猪塞尼卡谷病毒流行态势与诊断防控研究进展

　　摘要：塞尼卡谷病毒(Senecavalleyvirus，SVV)为小RNA病毒科塞尼卡病毒属的唯一成员，年首次发现于PER.C6细胞培养物中，被鉴定为细胞培养基中的污染物。最初SVV被用作溶瘤病毒进行肿瘤治疗研究。现已证实SVV感染猪能够引发原发性水泡病，引起猪的鼻吻、蹄部冠状带的水泡病变，同时伴有跛行、厌食、嗜睡和发烧等临床表现。与口蹄疫、猪水泡病和水泡性口炎引起的临床症状难以区分。-年期间，在美国、中国、泰国等多个国家暴发了SVV疫情，并且流行范围逐步扩大。针对该病的不断扩散，急需提出和制定有效的诊断与防控策略及措施。因此，一些新的诊断方法被不断开发出来，新的防控策略也在逐步建立。本文主要针对SVV最新的流行态势及特点、诊断与防控技术进行综述，旨在提供SVV最新研究进展，提高疾病防控及科研工作人员对该病的进一步认识和了解，为该病的防控提供理论依据和参考。

　　塞尼卡谷病毒(Senecavalleyvirus，SVV)也称为塞尼卡病毒A(SenecavirusA，SVA)，属于小RNA病毒科塞尼卡病毒属[1]。SVV与其他小RNA病毒科成员一样，具有直径约25nm-30nm的无囊膜衣壳，呈二十面体对称。SVV基因组长约7.2kb，为单链正股RNA，拥有一个唯一的开放阅读框(ORF)；ORF两侧为5′非翻译区(约个核苷酸)和3′非翻译区(约68个核苷酸)，3′非翻译区后具有多聚(A)尾巴。SVV唯一的ORF编码一个由个氨基酸组成的多聚蛋白前体。多聚蛋白前体可以被病毒蛋白水解酶逐步切割形成前导蛋白(Lpro)和3个主要的多聚蛋白(P1-2A、P2-BC和P3)。3个多聚蛋白进一步水解形成病毒衣壳的4个结构蛋白(VP4、VP2、VP3和VP1)和参与病毒复制的7个非结构蛋白(2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D)。

　　SVV多聚蛋白遵循小RNA病毒基因组的标准L-4-3-4布局，结构蛋白编码区在基因组的5′端，非结构蛋白编码区在基因组3′端。多聚蛋白的裂解主要包括：通过一种核糖体跳过机制使P1-2A与2BC-P3分离；3C蛋白酶通过其水解酶活性将L和P1以及2BC和P3裂解开来；L、2A和3C蛋白进一步对中间体蛋白进行切割形成成熟病毒蛋白。对分离的第一株SVV病毒(SVV-)的ORF序列分析发现，其P1、2C、3C和3D的编码区与心病毒属病毒相似性极高，但多聚蛋白的其他区域则与已知的小RNA病毒科其他成员差异较大。SVV的5′非编码区序列中含有内部核糖体进入位点(IRES)，其IRES结构与小RNA病毒的IRES差异较大，但与黄病毒科中猪瘟病毒(CSFV)的IRES元件(Ⅳ型IRES)的二级结构类似。这些研究进展表明SVV与其他小RNA病毒科成员相比具有其独特的特性。

　　1SVV的致病特征和流行态势

　　年，SVV首次在美国被报道，病毒被发现于PER.C6细胞培养物中，被认为是细胞培养基的污染物。年SVV被发现是引起加拿大发生的猪原发性水泡病(PIVD)的致病病原[5]。年以后，在美国、巴西等多国均发现SVV感染导致猪发生PIVD的临床病例，进一步确认了SVV对猪的致病性。SVV感染引发的水泡病与口蹄疫(FMD)、猪水泡病(SVD)和水泡性口炎(VS)引起的病变极为类似，具体表现为病畜鼻吻部、蹄部冠状带出现明显水泡，同时伴有跛行、厌食、嗜睡和发烧等症状。因此，仅从临床症状上无法区分SVV感染和其他水泡病。SVV是引起猪发生PIVD的致病因子的观点最初不被人们认可，因为当时并未从发病猪体内分离到活病毒，仅有测序结果。同时，由于常见的病毒感染，例如细小病毒、肠道病毒、食物供应中的毒素或烧伤都有可能形成类似的水泡病变，因此直到人为将SVV感染猪的病例复制出后，才确证了SVV对猪的致病性。本实验室前期证实育肥猪感染SVV后能够引起猪鼻部和蹄冠部产生显著的水泡病变，并成功分离了SVV毒株。现有研究已证实SVV感染后能引起断奶仔猪及保育、育肥和繁殖的各年龄段猪发生水泡病。这包括以前巴西、美国和中国报道的引起急性跛行、突发新生仔猪死亡和水泡病变临床症状的SVV感染病例。

　　比较有意思的是，在对更早的水泡病发病猪保藏样品进行测序分析时发现，自20世纪80年代后期以来，美国猪群中便存在SVV。自年确定SVV病原的存在至年初，SVV感染猪的病例只有在美国和加拿大零星发生。但自年下半年后，在巴西、美国、加拿大、中国、哥伦比亚等多国相继发生了SVV感染猪的疫情，而且呈蔓延之势。

　　年初，巴西的6个州报告了病因不明的水泡病疫情的发生，后经鉴定均由SVV感染引起。几乎与此同时，中国广东省在5月份也发生了PIVD疫情，其特征也是位于鼻吻和蹄冠部产生明显水泡，发病母猪伴随着发热和厌食，产房的仔猪急性死亡，经鉴定致病病原也是SVV。

　　年10月，泰国北部地区的一个育肥猪场发生了水泡病疫情，疫情持续了两周，暴发疫情的猪群共有头猪，其中头发病，但没有死亡；从12只发病猪收集的3个水泡液样品和9个蹄冠水泡皮样品进行了SVV测定，检测结果显示所有样品均为SVV阳性样品；对口蹄疫在内的其他水泡病病原进行检测，结果则均为阴性。本实验室年初鉴定了我国福建和河南再次发生的猪感染SVV案例，并证实毒株与美国流行毒株相似性极高，而与加拿大和巴西毒株相似性较低。截至目前，已有美国、加拿大、巴西、哥伦比亚、中国和泰国报道了SVV感染猪的案例(表1)，其他国家的流行情况仍不清楚，但根据现有研究报道显示SVV流行的地域正在逐步扩大，发生的国家数量也在近两年迅速增加，因此，其未来流行的动态需要持续。将美国、哥伦比亚、巴西和中国流行的SVV分离株序列与以往的SVV历史株进行比对分析发现，新出现的SVV毒株与历史毒株相比相似性显著降低(相似性为91%-93%)，这表明当下毒株和历史毒株相比已经发生了显著的进化和变异。变异和突变的积累可能增加了SVV致病性和传染性，因此，导致SVV快速流行开来。

表1SVV流行状况统计

流行国家

　　2SVV的鉴定和诊断

　　鉴于SVV快速传播的能力，建立高效、准确的诊断方法是进行该病防控的前提。目前已经用于诊断SVV的实验室方法包括病毒分离、病毒中和、竞争ELISA、常规RT-PCR和实时荧光RT-PCR(rRT-PCR)等方法。年在加拿大猪中检测到SVV后，迫切需要开发一种能够用于检测SVV的便捷、可扩展的血清学诊断方法。制备出SVV特异性单克隆抗体(mAb)显得尤为重要，借助制备的mAb可以开发SVV竞争性酶联免疫吸附检测方法(cELISA)或免疫组织化学反应。针对年加拿大发生的SVV疫情，Yang等制备了反应性很高的mAb，并成功开发了针对SVV的cELISA检测方法，证明其可用于猪体内SVV抗体的检测，并且与其他小RNA病毒没有交叉反应。然而，由于当时SVV阳性血清数量的限制，该检测方法并未得到充分验证。因此，在年大面积暴发SVV疫情后，Goolia等对先前开发的cELISA进行了进一步验证，同时还建立了病毒中和试验(VNT)方法以确保SVV的准确诊断。在开发VNT检测方法过程中，将cELISA、VNT和明尼苏达大学兽医诊断实验室建立的免疫荧光抗体检测(IFAT)方法进行了SVV检测的比对，对份SVV阳性血清和份阴性血清进行了检测。结果显示，cELISA的诊断特异性和敏感性分别为98.2%(97.2%-98.9%)和96.9%(94.5%-98.4%)，VNT为99.6%(99.0%-99.9%)和98.2%(95.8%-99.4%)，IFAT为%和90%。当基于卡帕系数(Kappacoefficient)进行比较时，cELISA、VNT和IFAT检测结果之间有很好的关联性和一致性。此外，该研究还证明建立的VNT方法对FMDV、VSV和SVDV并无交叉反应，具有很好的特异性。建立的cELISA同样与FMDV、VSV和SVDV无交叉反应，与VNT结果相符，表明%检测特异性。对IFAT、cELISA和VNT三种方法进行系统的比较表明均可用于SVV的检测。但在实际检测过程中，cELISA要优于其他两种检测方法，因为它的操作更快更简单，成本更便宜，不依赖显微镜观察，适用于大规模样本检测，因此可用于常规畜群的筛查。VNT和IFAT可作为进一步确诊方法，与cELISA结合使用。

　　除了血清学检测方法，针对SVV基因组的PCR检测方法也可以快速进行SVV的诊断。SVV的RT-PCR检测方法的建立对SVV的发病机制和流行病学研究具有重要意义。RT-PCR检测方法可以对SVV在环境的分布及传播的路线进行调查，对病毒在其他宿主中进行监测，鉴定新的传播媒介和途径，也可以进行组织嗜性和病毒载量分析。3D基因是SVV基因组中最为保守的区域，因此针对3D基因建立的RT-PCR方法比针对其他基因的检测方法灵敏度更高。现在已经建立了针对3D基因的实时RT-PCR方法，并证明其可以广泛用于SVV的检测。除了针对3D基因的RT-PCR，现在还建立了针对VP1的RT-PCR。

　　虽然针对SVV检测的VNT和cELISA方法已经建立，并且具有很好的特异性和灵敏性，但这些方法目前仍局限于实验室内部使用，未能推广应用。然而基于SVV基因组检测的RT-PCR方法可以快速推广使用，应用到SVV的流行病学调查及基础研究中。进一步研发可大范围推广使用的血清学诊断方法对于SVV的防控依然非常紧迫和重要。将不同种检测方法结合使用确保诊断结果的准确率和可信性，能够为SVV的防控提供有力保障和支持。

　　3SVV疫苗的研发

　　控制传染病最主要的手段是预防，而利用疫苗免疫进行预防是最为有效的措施，但目前仍然无可以推广使用的SVV商品化疫苗的报道。堪萨斯州立大学Chen等以SVV美国流行毒株KS15-01基因组为模板构建了SVV全长cDNA，并进一步建立了SVV感染性克隆pKS15-01-Clone，希望借助构建重组病毒，然后对病毒蛋白位点进行突变修饰开发出高免疫效力、无致病性的重组活病毒疫苗。感染性克隆的重要用途之一是能够作为外源基因表达的病毒骨架。然而插入增强型绿色荧光蛋白EGFP的示踪病毒是研究病毒生物学特性、发病机理和标记疫苗的重要工具。Chen等成功将EGFP的表达序列插入到SVV的2A和2B之间，获得了能够表达EGFP荧光蛋白的SVV重组病毒。该重组示踪病毒的获得为SVV致病机制研究和重组病毒疫苗的研发提供了非常好的研究材料。

　　Poirier等曾以SVV首个分离株SVV-为框架构建了表达EGFP的重组病毒SVV-GFP，用于开发基于SVV的溶瘤药物研究。其研究表明SVV-GFP仅在肺癌细胞系中表现临床病症，而在天然宿主细胞和动物中并不能引起任何病变。因此，Chen等同样研究了SVVKS15-01-EGFP重组病毒对宿主细胞及猪的致病性。结果表明KS15-01-EGFP重组病毒和其亲本病毒相比，它在体外和体内都能进行复制，并在感染动物中诱导相似水平的中和抗体和细胞因子，但相比之下，KS15-01-EGFP重组病毒在猪体内显示出较低的复制水平，EGFP的插入显著降低了重组病毒在宿主体内的复制水平。亲本病毒KS15-01感染的所有猪都表现出明显的蹄部病变，但KS15-01-EGFP重组病毒感染的猪未表现出任何临床症状。这些结果表明，EGFP插入的SVV病毒可作为无致病性重组病毒活疫苗研究工具。另外，灭活疫苗在传染病的防控中发挥着重要作用，已被广泛应用，灭活疫苗对病原进行了有效的灭活，提供了疫苗的安全性，因此，开发高效保护的灭活疫苗可以作为当下SVV防控研究的一个方向。

　　4SVV的其他用途

　　SVV在发现之初，主要研究方向是基于溶瘤病毒治疗的应用，它在不同类型的癌症治疗中具有潜在的治疗用途。SVV作为一种天然的溶瘤药物，具有选择性复制的能力，而且能杀死神经内分泌肿瘤细胞，因此该病毒作为癌症潜在治疗干预的工具应当被深层次研究。溶瘤病毒是可复制的病毒，其选择性地在癌细胞中引起细胞毒性而对正常组织无明显损伤。在实验室研究阶段，已经有使用SVV来感染具有神经内分泌特征的肿瘤，包括小细胞肺癌和小儿神经内分泌肿瘤等探索研究。初步数据表明SVV具有在肿瘤细胞内复制的能力。因此，SVV在医疗领域被认为是一个潜在的癌症治疗工具，关于其抗癌作用和机制有待于进一步深入阐明和应用。

　　5展望

　　老病不断、新病又添是当下我国养猪业面临的一个重大难题。近两年猪群中新发的PCV-3、猪颤抖病、SVV引发的水疱病不断出现，给我国的养猪行业带来了很大的危害。在这些新发病还未大范围流行前，如何有效地限制其进一步传播显得尤为重要。由于针对这些新发病目前尚无可用疫苗，一旦发生疫情，很难进行控制。为有效控制这些新发病在我国的流行和蔓延，急需建立有效的诊断方法，创制高效保护的疫苗。在SVV的防控中，新的研究方法和工具正在被快速地开发和评价，新的疫苗也在开发中；多种诊断方法的结合使用，配合疫苗免疫的预防，加上有效的控制计划和策略，相信在不远的将来SVV的流行会得到有效的控制。在SVV致病性研究方面，现在已经有了关于其受体鉴定、抑制宿主天然免疫反应相关的研究结果，为SVV的发病机理、临床诊断和免疫提供了数据支持和理论依据。虽然针对SVV的研究取得了一定的进展，但许多问题仍有待于深入研究，比如：(1)SVV病毒的具体特征，包括其生物学和分子进化特征，pH稳定性，感染与入侵途径，细胞大分子，复制周期，存活环境等；(2)仔猪致病机制；(3)宿主免疫反应，包括初乳中的保护性抗体滴度等。

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