HBVDNA检测技术目前已经在临床中普遍应用。但在实际工作中，不少临床医师对如何认识、评价和使用HBVDNA检测结果仍存在着一些困惑，甚至可能因认识不足、应用不当导致了错误的诊断和治疗。
现就HBVDNA定量检测临床应用的基因诊断和临床治疗研究阐述如下。
一、如何正确认识和评价HBVDNA定量检测试剂盒的灵敏度
任何一种基因检测技术都有一定的灵敏度，即该方法的最低检测限。目前公认的HBVDNA定量检测国际“金标准”是罗氏公司生产的COBASAmpliPrep-COBASTaqMan(CAP-CTM)实时荧光PCRHBVDNA定量检测试剂盒，其血清HBVDNA检测灵敏度为拷贝／mL(30IU/mL)。
有学者将雅培公司生产的HBVDNA定量检测试剂盒与CAP-CTM进行了比较，发现两者灵敏度相似。目前，国产的HBVDNA实时荧光PCR定量检测试剂盒灵敏度为1×拷贝／mL，与国外产品尚有一定差距。虽然某些国产试剂盒声称检测灵敏度可达或拷贝／mL，但无充分实验室或临床证据。有研究显示，将24份罗氏公司第一代产品COBASAmplicor试剂盒HBVDNA定量在-拷贝／mL的患者血清，分别采用2个国产HBVDNA试剂盒进行检测，发现后者的漏检例数分别达11例(45.83%)和22例(91.67%)。
与国产试剂盒相比，罗氏公司的CAP-CTM检测系统之所以具有较高的灵敏度，除试剂本身的质量及配套的仪器性能等因素外，从技术层面看，尚有其他重要原因：
①该检测系统在从血清中分离、提取HBVDNA时，采用的是全自动的HBVDNA提取系统COBASAmpliPrep，且采用的是磁珠吸附柱纯化，尽可能地避免了提取过程中HBVDNA的丢失，而国产试剂盒均采用手工提取，且多为煮沸法、Chelex树脂法等，提取过程中HBVDNA丢失较多。有学者研究发现，即使采用同一检测试剂，血清标本的处理方法对HBVDNA检测结果也有着直接的影响，煮沸法和Chelex树脂法阳性检出率仅为吸附柱核酸纯化法的52.78%和55.56%。在阳性标本中，同一标本的定量值也较吸附柱核酸纯化法低1-2lg拷贝/mL。②该系统用于检测的每份血清标本量较大。CAP-CTM试剂盒用于检测的每份血清量达uL，而国产HBVDNA检测试剂盒用于检测的血清标本量一般仅为50-uL，但两者提取到的待测HBVDNA产物容积一般均为50uL。而且，由于反应管体积的限制，进行PCR检测时只能再取其中的2-5uL的HBVDNA提取产物作为PCR检测的模板。
在血清HBVDNA含量较低时（1×拷贝/mL以下），在有限的2-5uLHBVDNA提取产物中，能“抓到”多少HBVDNA分子进入到PCR检测反应管，并被仪器“捕捉”到荧光信号，就存在着一个概率问题：进入检测体系的血清标本量越多，“抓到”足够多的HBVDNA分子的概率就越大，荧光仪捕捉到荧光信号的概率也就越高。
反之，血清标本量越少，检出概率越低，漏检率也就越高。显而易见，罗氏试剂盒由于增加了进入检测体系的样品容积，其敏感度理论上就比国产试剂盒提高6-13倍。
国产HBVDNA定量检测试剂盒的灵敏度偏低可以解释某些临床现象：
①CHB或乙型肝炎肝硬化患者多次检测血清HBVDNA1×拷贝/mL，在除外合并脂肪肝、药物性肝损害等其他病因后，仍反复出现血清ALT、AST升高；②或在接受抗病毒治疗后，监测血清HBVDNA已长时间处于不可测水平以下，但血清ALT和AST即使加用“降酶药”后仍持续异常。其中的原因可能就是患者体内存在低水平的HBV复制，但国产试剂盒却未能检测出。鉴于我国大多数乙型肝炎患者的经济承受能力有限，没有必要普遍推广使用高灵敏度、高成本的进口试剂盒，因为目前尚无彻底清除HBVDNA的药物，即使患者血清HBVDNA降到更低的不可测水平，甚至发生血清HBsAg转换，但肝脏中仍然会有HBVDNA或HBVcccDNA存在。
在抗病毒治疗的动态监测过程中，只要患者血清HBVDNA持续1×拷贝／mL，结合生物化学、影像学和（或）组织学等指标，就足以对疗效进行恰当的评价。
只有在HBVDNA水平用国产试剂盒检测1×拷贝／mL，但①患者未经治疗，ALT持续异常；②或在抗病毒治疗过程中，出现ALT持续不能复常，或复常后又反弹；③或肝脏影像学、组织学有进展；④或有肝硬化、肝细胞癌家族史等高危因素；⑤或HBV血清学标志物阴性、但疑有隐匿性乙型肝炎等少数情况下，可以考虑使用高灵敏度的HBVDNA检测试剂盒。
二、如何看待HBVDNA定量检测试剂盒的检测线性范围任何检测方法，只有在一定的范围内才有效，即该方法检测的线性范围。检测线性范围包括检测的上限和下限，下限即为检测灵敏度，上限即为其最高检测浓度，待测标本中，如目标分子的浓度低于检测下限可能导致漏检；如高于检测上限，由于高浓度底物的抑制效应，亦有可能导致误检甚至漏检。
影响HBVDNA定量检测试剂盒线性范围的因素有：
①定量标准品设置的范围。荧光定量PCR检测时，一般均采用标准曲线法，只有检测数值位于标准品的定量范围内，结果才是有效的、准确的，不能通过统计公式任意加以外推。
部分国产HBVDNA定量检测试剂盒说明书上标明检测线性范围为-1×拷贝／mL，但实际可能只有1×、1×、1×和1×拷贝／mL4个数量级的标准品，显然是不严谨的。
如待测标本的检测结果低于1×拷贝／mL或高于1×拷贝／mL，均是不可靠的。
②检测试剂的质量，如PCR引物和荧光探针的保守性、通用性，试剂盒所采用的Taq酶的扩增能力、热稳定性，以及反应体系抗干扰系统的设置等，均会直接影响PCR的扩增效率和检测线性范围。
HBVDNA检测试剂盒的线性范围越大，表明其检测效能越高。罗氏、雅培和Qiagen公司的HBVDNA定量检测试剂盒的检测线性范围分别为30-1×IU/mL、10-1×IU/mL和20-1×IU/mL。
根据作者多年的基因实验室和临床工作经验，多数国产试剂盒的线性范围在1×-1×拷贝／mL，虽检测效能较国外试剂盒小2个数量级，但基本能满足临床需要。建议对于使用国产试剂盒检测结果为1×拷贝／mL或以上的血清标本，实验室技术人员可常规对标本进行1:-1:的稀释，然后再次进行检测。这样能确保血清高载量HBVDNA的样品检测结果更准确，在抗病毒疗效监测中也能更有效地反映患者实际HBVDNA的下降程度。
三、如何看待不同实验室之间HBVDNA载量检测结果和单位的差异
常会看到同一患医院相近时间段（未经抗病毒治疗），医院（实验室），所测得的HBVDNA载量有差异，甚至有很大差异。
究其原因，应该包括两个方面：一是检验技术本身固有的“缺陷”，或必然存在的误差；二是试剂、设备和人员技能的差异。由于HBVDNA检测结果是指数形式，且HBVDNA本身易发生突变而影响引物和探针的结合，因此不同厂家的HBVDNA检测试剂盒之间的检测结果不具有可比性。
在一项研究中，来自美国9个独立实验室的学者，对67份血清标本分别采用雅培公司的HBVIUO、罗氏公司的CAP-CTM和HighPure-CTM、Qiagen公司的artusHBVTMASR等HBVDNA检测试剂盒进行检测，发现尽管上述试剂盒在检测下限、线性范围、可重复性方面均较好。
但①检测结果的中位数以CAP-CTM最高，artusHBVTMASR最低；②检测结果的可重复性以具有全自动DNA提取系统的试剂金较好；③所有试剂盒均有假阳性结果，其中使用手工DNA提的试剂盒发生率较高。
鉴于不同方法、不同买验室检测结果之间的差异，欧洲肝病研究会指南特别强调，对治疗过程中HBVDNA的随访监测，同一患者需要采取同一种方法。
我国有关核苷（酸）类药物耐药预防与管理的专家共识也明确指出，为确保检测结果的稳定性和一致性，对于在同一地方就诊的同一患者，应坚持采取同一种检测方法进行评估。HBVDNA定量检测结果以拷贝／mL表述较为直观，易于为临床医师和患者理解。但如采用不同厂家试剂盒进行检测，且结果用拷贝/mL表述，其差异较大，不便于比较。为解决这一问题，由9个国家、22个实验室组成的协作组，对3份阳性血清标本采用不同厂家的HBVDNA试剂盒进行检测，并将检测结果进行标准化，最后产生一份来自欧洲的“标准血清”（代号97/），作为HBVDNA核酸扩增检测技术的标准品，定义为1×IU/mL（5×／反应管），这一标准已被世界卫生组织(WHO)所承认。年，该标准血清被一代号为97/的新标准血清取代。各试剂生产厂家如罗氏、雅培、Qiagen等，均把待测样品的实测值（拷贝/mL），用WHO的标准血清检测结果进行标化后，赋予标准化值，即IU/mL。不同厂家的试剂盒，拷贝／mL与IU/mL的换算系数不同：罗氏公司CAP-CTM试剂盒1IU/mL=5.82拷贝／mL，Qiagen公司的ReaIArtHBVPCR试剂盒1IU/mL=6拷贝／mL，西门子VERSANTHBVDNA试剂盒1IU/mL=5.7拷贝／mL，雅培公司实时荧光定量HBVPCR试剂盒1IU/mL=3.41拷贝／mL。但为便于临床医师计算，目前国内外相关指南均统一采用1IU/mL=5拷贝／mL进行换算。需要特别指出的是，目前部分国产试剂盒的报告单位“IU/mL”与“拷贝／mL”的实际换算系数是1，但为了人为地“与国际接轨”，把报告单位标注成“IU/mL”。
四、如何看待与处理HBVDNA定量检测结果的假阴性与假阳性任何检测方法均可能存在假阴性和假阳性。所谓HBVDNA定量假阴性是指标本中存在HBVDNA却未能检测出来，假阳性是指本来不存在HBVDNA却报告检测出阳性结果。造成HBVDNA定量检测假阴性的常见原因有：①HBVDNA检测试剂盒灵敏度较低，使HBVDNA载量较低的标本漏检；②标本采集、运送或保存不当，导致HBVDNA被DNA酶降解、断裂；③标本中存在抑制PCR过程的物质，如肝素抗凝、血脂过高、溶血等；④HBVDNA发生变异，致使PCR检测的引物、探针与HBVDNA靶片段不能有效互补结合，不能形成扩增产物或无法产生荧光信号。
作者曾接诊1例HBsAg、HBeAg阳性CHB患者，其未曾进行抗病毒治疗，多次在外院查肝功能均示ALT升高，但同时多次查HBVDNA均1×拷贝／mL，并排除合并其他病因，该医院同期其他患者的检测结果亦未发现异常。
后该患者在解放军第四O四医院复查HBVDNA为5.6×拷贝／mL，HBVDNA测序发现，该患者HBVDNA在外院检测时试剂盒所采用的正义PCR引物3’末端存在两个碱基的突变。造成HBVDNA检测假阳性的原因：①标本被污染；②因操作不当或试剂质量等原因导致扩增曲线不平滑、不稳定，在一定热循环数以后扩增曲线出现折线或“翘尾”现象，被系统误检为阳性信号。后者可导致一种令临床医师和患者特别困惑的现象，即已长时间抗病毒治疗的患者，突然检测到低水平的血清HBVDNA，一般在最低检测限左右，如(1-2)×拷贝／mL，被误以为病毒学反弹或复发，医院医院进行复检，结果HBVDNA低于检测下限。对于此种结果，最好的处理办法是进行重复检测。HBVDNA检测假阳性与假阴性的发现，有赖于临床医师与检验技术人员保持良好的沟通。当临床医师对检测结果有疑问时，应及时向实验室提出，实验室技术人员应采取核对标本是否有误、重新检测、重新抽血、更换检测试剂盒等方法加以复核。
五、如何看待HBVDNA检测与免疫学检测之间的关系HBVDNA定量检测是HBV感染的一种病原学诊断手段。与HBV感染的传统病原学诊断手段--HBV血清学标志物检测相比，其优势是高灵敏度，甚至能发现血清学标志物全阴性的隐匿性乙型肝炎。
但HBV血清学标志物检测有其独特的优势，可提供基因诊断无法提供的信息：
①免疫学诊断不仅可以通过HBsAg和HBeAg来反映HBV的存在与否，还能反映机体对HBV的免疫应答状态。如HBeAg的血清学转换提示机体对HBV的细胞免疫功能有所好转；如单独出现HBeAg的消失而不伴有抗-HBe的出现，则主要反映病毒被抑制而不是免疫功能的好转；如继续出现HBsAg的血清学转换，代表机体对HBV免疫功能的显著好转或痊愈。②免疫学诊断可为基因诊断提供补充信息和线索。例如，同样是未经治疗的HBVDNA载量为1×拷贝／mL的两例CHB患者，如果一例HBeAg阳性，而另一例HBeAg阴性，则预示着患者的HBVDNA可能存在前C区和（或）基本核心启动子区基因变异。③免疫标志物检测可作为抗病毒疗效评价的补充手段。有研究显示，在干扰素治疗CHB过程中，HBsAg定量的快速下降是HBeAg阳性CHB患者HBeAg血清转换的预测因子，对HBeAg阴性CHB实现治疗后持久病毒学应答(sustainedvirologicalresponse,SVR)和HBsAg消失也有很好的预测作用。因此，我国的相关专家建议中，明确提出把HBsAg定量和HBVDNA的动态变化作为应答指导治疗(responseguidedtherapy，RGT)策略的主要预测、指导指标。④血清HBsAg和HBeAg检测对肝细胞癌有一定的预测作用。中国台湾一项对初治、无肝硬化的例患者进行平均14.7年的随访研究显示，HBeAg阳性、高载量HBVDNA均与肝细胞癌的高发病率相关。HBsAg也与肝细胞癌风险具有量效相关性。特别是对于HBeAg阴性、低血清HBVDNA载量者，HBsAg≥IU/mL者发生肝细胞癌的风险是HBsAgIU/mL者的5.4倍。作者认为，在预测肝细胞癌方面，HBsAg水平可作为HBVDNA的补充。
六、结语
HBVDNA定量检测应用于临床后，不仅是一种检测技术，更是一种诊断手段。
要在临床上正确应用HBVDNA定量检测，临床医师首先需对检测结果的临床价值有正确的认识，并据此进行相应的临床决策，如是否需进行抗病毒治疗或进行HBV宫内感染阻断、是应答不佳还是已发生耐药、进展至肝硬化或肝细胞癌的风险等。其次，临床医师还需对HBVDNA定量检测技术本身有所了解，如荧光定量PCR检测的基本原理及其不同于其他检验技术的基本特点（扩增能力强、灵敏度高，但同时检测结果波动大、室间差异大）等。
对本单位所采用的试剂盒的灵敏度、线性范围等则需有恰当的评价，不能为说明书所左右。
再次，临床医师还需将HBVDNA检测与其他诊断手段相结合，并与检验技术人员保持有效的沟通，才能对患者的病情做出正确的、全面的评价，避免错误的诊断乃至错误的治疗。总之，临床医师只有不断更新专业知识，不断加深对HBV基因诊断技术的理解，并正确和合理地应用于临床实践，才能造福于广大乙型肝炎患者。
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