作者郭晓强
为快速鉴定新冠肺炎病毒携带者或确诊相关病例，通常需要对特定人群开展病毒核酸检测，包括样品采集、核酸提取、病毒基因片段扩增及检测等过程，这在减缓和预防新冠肺炎的快速传播方面有着巨大的价值。新冠肺炎（coronavirusdisease,COVID-19）目前已成为影响全球最严重的肺部传染性疾病，至今蔓延到多个国家和地区，截至年9月10日，确诊多万病例，死亡90余万人，是当今危害人类健康和经济发展的重大难题之一。引发新冠肺炎的病原体为严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severeacuterespiratorysyndromecoronavirus2,SARS-CoV-2，以下简称新冠肺炎病毒）[1]，因此为遏制新冠肺炎快速蔓延，必须尽快检测出新冠肺炎病毒感染者并排除非携带者，以便采取针对性的预防措施。
筛查新冠肺炎病毒的手段
检测新冠肺炎病毒，首先须了解病毒基本构造。新冠肺炎病毒是一种圆形或椭圆形的颗粒状病毒，直径约纳米，小于普通光学显微镜分辨率（纳米），因此若想揭开新冠肺炎病毒的庐山真面目，通常要借助电子显微镜的威力。新冠肺炎病毒在感染早期有两大特征，一是病毒个体太小，二是病毒数量太少。要直接观察病毒，首先得对病毒进行体外培养，然后进行繁琐的样品制备，最后方可在电子显微镜下观察。这一漫长而成本昂贵的过程，显然不适合病毒的快速筛查，必须另辟蹊径。
新冠肺炎病毒构成较为简单，主要含两种基本物质，一种为发挥结构和功能作用的蛋白质，另一种为发挥遗传作用的核酸。核酸有两种，脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA），而新冠肺炎病毒携带的是RNA。这样看来，如能发现新冠肺炎病毒蛋白质或RNA的蛛丝马迹，也就明确了病毒的存在。理论上，蛋白质和核酸均可用作检测目标，但核酸有一个得天独厚的优势，就是可在体外扩增（蛋白质检测通常需要使用信号级联放大，其敏感性不及核酸），这就很好地弥补了病毒数量少的不足，于是核酸检测就成了新冠肺炎病毒筛查的主要手段。
核酸扩增
病毒核酸检测亦称分子检测，主要利用核酸强大的体外扩增能力。尽管DNA和RNA均可直接体外扩增，但通常应用DNA的比较多。对于遗传物质为RNA的新冠肺炎病毒，先要将RNA转变为DNA，这个过程称为逆转录（reversetranscription,RT），就是利用RNA做模板，在逆转录酶的催化下生成DNA，通过这一过程把病毒RNA的信息忠实传递给DNA。下一步是DNA体外扩增，其方法称为聚合酶链式反应（polymerasechainreaction,PCR）。所谓链式反应，通常是指一个连锁反应（可类比核裂变原理），前一个反应的产物作为后一个反应的底物，使产物发生几何级数增长（2、4、8、16、32、64……），最终实现产物的快速积累；PCR是在DNA聚合酶催化下，DNA体外连续复制的过程。为检测病毒，通常并不需要把整个病毒基因组全部扩增，只需选择几种有代表性、排他性的基因即可。基因是指具有一定生物学功能的DNA片段，不同基因之间的差别在于4种碱基（A、G、C和T）排列顺序的不同，碱基间按照A和T配对、G和C配对的原则进行配对。因此，DNA聚合酶可根据一条DNA单链的碱基顺序精准合成另一条配对链（即DNA复制）。开始复制时必须先有一段短的DNA单链与已有DNA配对才可启动延伸过程，这条短DNA单链称为引物（引导DNA聚合酶开始工作之意），它们可与选定的DNA片段两端互补配对，最终达到只扩增引物之间序列的目的。[2]
病毒核酸的检测及其体外扩增
PCR过程通常包括重复的三步反应。
第一步：高温变性。将双链DNA拆为单链DNA，为下一步的DNA复制做好准备。
第二步：低温退火。退火就是单链DNA重新形成双链的过程。尽管原来两条单链DNA有机会重新结合，但由于体系里已加入大量的单链引物，因此最终结果是单链引物与单链DNA形成杂合双链DNA。
第三步：适温延伸。DNA聚合酶在合适温度下可根据DNA信息，以引物为起始，将剩余部分填充。
随后重复进行“变性—退火—延伸”三步，从而实现目的DNA（通常在第三个循环后出现）的体外快速扩增，最终到达检测水平。目前，通常让退火和延伸采用同一温度，以减少频繁的变温操作，节省时间。
病毒核酸检测
理解核酸体外扩增原理后，重点介绍新冠肺炎病毒核酸检测，通常包含收集、提取、扩增和检测等步骤。
收集
由于新冠肺炎病毒主要聚集于上、下呼吸道，因此取材部位亦主要集中于此。筛查最常用的工具是口咽拭子，鼻咽拭子也有采用。有时还需收集下呼吸道分泌物或支气管肺泡灌洗液等供进一步确诊。
提取
提取是从收集物中提取病毒和人RNA的过程。相对于DNA，RNA稳定性较差，应在采样后最短时间内完成提取，以免降解。如果受具体条件所限，无法短时间内完成提取，则应及时低温保存，短期需在4℃保存，超过72小时则需在－80℃或液氮中保存。运输过程中也应保持低温环境。
扩增
对提取的RNA进行RT-PCR体外扩增。多种新冠肺炎病毒基因均可作为检测基因，如核衣壳（nucleocapsid,N）蛋白等。为使结果更加可靠，通常选一个基因的两个片段或两个基因的两个片段；此外还选择一个人的基因作为内部参考（保障试剂有效性），共3对特异引物。
检测
如果目的片段存在，就会得到经多次扩增而最终检测到的信号[3]，进而可判断病毒携带情况。
扩增结果通常有如下几种情况：
①三个目的片段均未得到阳性，这种情况为无效结果，需要排查原因并重新操作。
②人基因阳性，两个病毒基因阴性，说明核酸阴性（健康人）。
③人基因阳性，两个病毒基因亦阳性，说明核酸阳性（携带者）。特殊情况下，如果两个病毒基因只有一个阳性，则须重新操作；更罕见的情况是两个病毒基因阳性，但人基因阴性，也考虑为阳性（可能原因是人RNA过少）。
新冠肺炎核酸检测原理示意[3](a)病毒核酸检测过程；(b)核酸检测结果解读。核酸检测通常采用单样检测（每个样本单独进行核酸检测），但有时为减少检测次数、降低检测费用和提升检测效率，也会使用混样检测。混样检测是指首先把多个样本（通常是5~10个）混合后检测，若结果阴性则证明样本中所有个体均未感染病毒；如阳性则需进一步测定单一样本，从中发现确切感染者。举例如下：假定一万个样本，单样检测至少一万次（不考虑阳性和阴性对照）；如果每10个样本混合，估计感染率百分之一，则第一步仅需检测一千次。按最极端情况估计，这一百个感染者分到一百个组，则再需检测一千次，最终两千次即可达到要求，这就极大提高了检测效率。
核酸检测可靠性
目前，基于RT-PCR体外扩增的检测已成新冠肺炎病毒核酸检测的金标准。即使如此，也无法保证完全准确[4]，总会有假阳性（健康人误判为感染者）和假阴性（感染者误判为健康人）的可能存在，主要出于以下几种情况。[5]
收集操作不当
目前对新冠肺炎筛查的最佳样本和最佳时间，尚缺乏统一标准。以口咽拭子为例，取样部位不准确可导致假阴性出现；对高度可怀疑的个体，通常要多次采样。此外，样品收集通常涉及多个标本，无形中增加了污染的概率而导致假阳性。此外，取材时机也非常关键，通常感染初期假阴性较多，随着时间推移，准确率会逐渐升高。
核酸提取失误
样本储存、运输或提取处理不当，容易使病毒核酸降解，而增加假阴性的机会。
扩增效果不佳
严禁使用过期或不合格试剂，这是保证扩增效果的关键。为此，通常在检测个体样本的同时还需增加三个对照，核酸分别来自水、确定健康人和确诊患者。如果最终三个结果符合预期，则判定试剂合格。
检测限设置
为判定核酸阳性或阴性，通常需设置检测限（limitofdetection,LOD），它是指次检测中95次以上出现阳性所需要的最小病毒RNA量。LOD数值设置非常关键，过高容易漏检（病毒数量过少者被忽视），出现假阴性；过低则容易使样品污染成为棘手的问题，假阳性增多。
最后，鉴于整个检测过程涉及众多专业操作，因此对工作人员的严格培训至关重要，尤其在核酸扩增和结果解读的阶段，更需要有资质的人员来完成，以保证结果可靠性。
病毒核酸检测的其他方法
由于新冠肺炎感染形势严峻，单纯依靠RT-PCR体外扩增策略难以满足实际需求，因此还有多种方案可作为补充[6]。
逆转录环介导的等温扩增（reversetranscriptionloop-mediatedisothermalamplification,RT-LAMP），也是采用逆转录方式将病毒RNA转换为DNA，然后采用一种特殊的DNA聚合酶和一组特殊引物在等温条件下（没有高温变性环节）将病毒目的片段扩增，最终通过判断产物生成量来确定其是否感染病毒。这种方法高效、经济，在新冠肺炎病毒检测上具有重要潜力。
转录介导的扩增（transcription-mediatedamplification,TMA），采用逆转录与转录相结合的扩增模式：一方面借助逆转录酶将病毒RNA转换为DNA（额外多出一段转录起始位点），另一方面再借助RNA聚合酶转录出包含目的片段的RNA，随后通过逆转录—转录循环，实现核酸的体外扩增。
基于CRISPR的测定（CRISPR-basedassay），这类方法首先进行核酸扩增，然后借助CRISPR系统的酶切功能（具有水解携带荧光的DNA的能力）检测扩增产物，存在病毒基因扩增片段的则释放荧光信号，不存在的则不发荧光[7]。
这些方法在其他病毒检测中已有一定程度的应用，因此在弥补RT-PCR检测之不足方面有重要价值。
病毒抗体检测
新冠肺炎病毒核酸检测对判断是否感染病毒至关重要，为使结果更可靠，通常还会加做抗体检测。抗体检测又名血清学测试，就是检测血清中特定抗体的含量。机体被新冠肺炎病毒感染后，并非坐视不管，而是及时启动免疫系统来抵御病毒，主要有细胞免疫和辅助性的体液免疫两种。
体液免疫就是B淋巴细胞产生针对病毒特异蛋白如刺突蛋白和包膜蛋白等的抗体，这些抗体统称免疫球蛋白（immunoglobulin,Ig），通常有IgM和IgG两种。IgM出现较早，在感染几天到2周内的急性感染期含量会迅速增加，随后逐渐下降；IgG出现较晚，但持续时间较长，是机体抵御病毒感染的主要抗体。因此，检测血清中IgM和IgG的含量，对分辨感染与否、感染后状态如何，具有重要的价值[8]。
针对新冠肺炎病毒抗体的简便型检测及其结果解读[9]检测试纸前端有一点样孔，可容纳1~2滴血，滴入的血样从前段扩散到后端，经过3个抗体检测带（IgM、IgG和对照），只有对照抗体处显色，结果才可信。根据IgM和IgG带显色情况，分为四种结果：双阴性，未曾感染，但不排除已感染病毒而尚未产生抗体，需进一步观察。IgM阳性，近几天曾感染，且传染性较大，需马上隔离。双阳性，已感染1~2周，仍有一定传染性，需隔离。IgG阳性，几周前曾感染过，但已获免疫力，病毒传播概率较低。上述情况均是针对无症状感染者，若出现症状则需及时治疗。抗体检测的理论基础在于抗原（即新冠肺炎病毒的特异蛋白）与抗体的特异性高亲合力，两者结合通常会触发发光反应，从而可被仪器或肉眼观测。目前主要分为两种类型，一种是实验室级别的检测，具有敏感性好和精确性高等诸多优点，但也有过程繁琐、成本高和专业性强等问题，适合临床诊断；另一种为简便型检测，只需一张试纸即可，具有操作简便、结果直观等优点，适合人群筛查[9]。
病毒变异的监测
新冠肺炎病毒核酸检测和抗体检测相辅相成[10]，一方面可以说明感染情况，另一方面还可提供感染后的信息。除检测外，有时还要监测病毒基因变异的情况。
基因变异是病毒的一个基本特征。当然，变异并非总是坏事，因为大多数变异是无害的，甚至部分变异还会带来好结果（如毒性减弱），只有极少数变异会引发更坏后果（致病性增加导致疫苗失效），因此检测病毒变异状况意义重大。
与DNA病毒（如疱疹、天花和人乳头状瘤病毒等）相比，RNA病毒（如流感、麻疹、艾滋病病毒，丙肝病毒和新冠肺炎病毒等）更容易变异，从而给疫苗开发、药物研发和预防措施提出了更大挑战。目前疫苗开发失败的案例基本都涉及RNA病毒，如流感、丙肝和艾滋病等。基于此，需要经常性地对新发现患者进行新冠肺炎病毒全基因测序，时刻监控变异发生情况，并预测潜在风险，做到未雨绸缪，制定更佳的预防措施和治疗方案。
目前，新冠肺炎病毒感染形势异常严峻，开展核酸检测和抗体检测意义重大，尽管这些方法都存在不完善之处，但可让我们及时掌握病毒感染传播动态，为疫苗研发和新药研制争取宝贵时间。
郭晓强：副教授，石家庄职业技术学院，石家庄。xiaoqiangguo
.