研究背景
脑膜炎和脑炎是中枢神经系统(CNS)疾病的主要原因，常导致严重的神经系统损害甚至死亡。传统检测手段依赖病原体特异性检测，耗时长，且仍有40-60%的脑膜炎或脑炎患者没有明确病因。
宏基因组二代测序(mNGS)越来越多地被用作临床诊断试验，虽然有了测试性能的标准，但尚未标准化。
论文概要年8月31日，来自美国的AnnePiantadosi等人在mBio(IF:6.）发表题为“EnhancedVirusDetectionandMetagenomicSequencinginPatientswithMeningitisandEncephalitis”的论文。该研究通过mNGS技术检测68名CNS感染患者来识别潜在的病原体，并使用靶向捕获对病毒进行靶向测序，以评估标准mNGS在识别中枢神经系统病原体方面的实用性及两种增强病毒核酸检测的方法：靶向捕获(HC)和甲基化DNA去除(MDD)。
研究阐述图1流程图，主题选择和mNGS方法概述。显示了登记(A)、实验室方法(B)和分析方法(C)。如图所示，一部分样品包括了用于甲基化DNA去除和杂交捕获（虚线）的增强实验室方法。缩写：CSF，脑脊液；WBC，白细胞。
1.临床特征研究者前瞻性地纳入68名已知或疑似CNS感染的患者，并对RNA和DNA进行mNGS以识别病原体。68名成年人中，63%（43/68）为男性，年龄从24-86岁(中位数=58岁)，25名患者(37%）免疫功能低。56%（38/68）患者出现精神状态改变，少数患者有光恐惧症（24%）或颈部僵硬（26%）（18/68）。68名患者中有20名（29%）入住重症监护病房(ICU)，住院死亡率为6%（4/68）。
根据临床检测，68名患者中有44人得到了出院诊断，12例患者经脑脊液PCR诊断为病毒感染，25例经血清学或血液PCR诊断为感染，7例为非感染性病因，其余24名患者（35%）没有已知的诊断。对这些被归类为“unknown”的患者进行了详细的传染病检测，脑脊液PCR组进行感染病检测的次数中位数相比“unknown”组低,同时住院时间(LOS)也较短，整体来看住院时间与检测数量相关。
图2
2.mNGS和增强方法的结果对68份脑脊液、3份血浆、5份血清和12份尿液样本以及47份阴性对照进行DNA以及RNA检测，平均每个患者产生万reads。在22名患者（32.4%）中确定了一个病原体：18个使用标准mNGS，另外2个使用HC方法，2个使用MDD方法。与预期的一样，在脑脊液PCR组的大多数患者中检测到病毒核酸（12例[83%]中检测到病毒核酸）。一名单纯疱疹病毒2(HSV-2)感染的患者和另一名人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)感染的患者的mNGS呈阴性，说明mNGS对非常低水平感染的敏感性可能低于PCR。一个患有HIV和进行性多灶性白质脑病(PML)的患者中同时检测到了JC病毒和HIV的reads，说明了这个单一平台识别病毒合并感染的能力。
图3使用或不使用增强方法的mNGS在脑脊液中鉴定的病毒。热图中行为病毒名称，列为样本，行按RNA病毒或DNA病毒进行分组。颜色强度对应于该病毒的RPM。红框对应RNA文库中的检测，蓝框对应DNA文库中的检测。在RNA文库中检测到一些DNA病毒。灰色阴影柱表示没有进行DNA或RNA测序的样本。此处发现污染物的样品为空白列。X代表临床诊断。黄条表示每个患者的脑脊液有核细胞计数。从左上角到右下角的四组对应PCR阳性诊断的感染、血清学或血液PCR诊断的感染、病因不明的患者和阴性对照。
评估两种增强方法，HC增加了9例常规阳性病例中8例的病毒reads数量，相比之下，MDD导致不稳定结果，部分文库reads提高，部分文库reads降低。
图4针对mNGS的增强方法。(A)对RNA样本（橙色）和DNA样本（蓝色）的HC、MDD和HC+MDD的病毒丰度进行比较。靶向捕获提高了DNA和RNA病毒的总体覆盖范围，如肠病毒(C)和JC多瘤病毒2(D)。甲基化的DNA去除改善了一些DNA病毒的覆盖率，如JC多瘤病毒2(D)，但一些其他病毒如EBV（B），它在其生命周期中利用宿主的甲基化，没有改善。
3.mNGS可以检测到临床未检测的病原体在24名未确诊临床诊断的患者中，标准mNGS在3名患者中发现了病毒，使用MDD和HC未检测到其他病原体：在两名淋巴细胞性脑膜炎患者中检测到肠道病毒，临床未检测肠病毒；两次因复发性淋巴细胞性脑膜炎连续住院的一位患者检测到了EBV，并组装成了完整的基因组。
4.mNGS和增强方法检测到临床意义不确定的病毒4名患者的脑脊液中EBV水平较低：其中3名有其他主要诊断；1名没有发现其他病毒,只有在MDD和HC后才检测到EBVreads，脑脊液的EBV临床PCR为阴性。对这些患者的临床数据的回顾表明，EBV和临床表征无关，可能处于潜伏期。
在一名经临床PCR诊断为HSV-2的患者中低水平检测到人疱疹病毒7(HHV-7)，但mNGS未检测到HSV-2，HHV-7引起的急性脑炎较罕见，与该患者的临床表征不一致。在两个患者中检测到腺病毒reads，由于它们在整个基因组中的分布，不认为是污染物，然而，reads仅在RNA库中发现，患者不清楚是否存在免疫功能低下或具有与腺病毒感染相符的特征。
5.mNGS对非感染性诊断的患者均为阴性mNGS在7例非传染性疾病患者中未检测到病原体核酸，在这类患者中，脑脊液白细胞计数的中位数比两个感染组患者低2-6倍。患者最终接受了免疫抑制剂的治疗。
小结本研究结果强调了mNGS的几个重要好处，包括减少对临床特异性诊断的依赖、组装病原体基因组，并可能提供比血清学更短的检测时间。将mNGS纳入临床诊断工作流程的一个潜在策略是在临床诊断的早期广泛实施，以此进行常见病原体的一步检测，可能减少患者不必要的检测并降低总体成本。另一种方法是将这种特殊的技术推荐给具有高感染概率的患者（例如，免疫功能低下）。mNGS的广泛应用需要通过临床医生和mNGS专家之间的密切沟通来评估检测到的病原体的合理性。考虑到背景reads和污染，以及对mNGS检测特征的理解，这一点尤为重要。
总体而言，研究者的工作有助于阐明mNGS如何集成到CNS感染的诊断工具包中。
原文PiantadosiA,MukerjiSS,YeS,LeoneMJ,FreimarkLM,ParkD,AdamsG,LemieuxJ,KanjilalS,SolomonIH,AhmedAA,GoldsteinR,GaneshV,OstremB,CumminsKC,ThonJM,KinsellaCM,RosenbergE,FroschMP,GoldbergMB,ChoTA,SabetiP.EnhancedVirusDetectionandMetagenomicSequencinginPatientswithMeningitisandEncephalitis.mBio.Aug31;12(4):e.doi:10./mBio.-21.EpubAug31.PMID:;PMCID:PMC.
编译：赖文杰
校审：练昌林编辑：赖文杰预览时标签不可点收录于合集#个上一篇下一篇