冬季是流感流行的高发季节，流感的流行严重影响了人们的日常工作和生活。流感病毒是分节段的RNA病毒，具有易重配易突变的特点，根据基质蛋白和基因组结构分为A、B、C、D四种类型，也称为甲、乙、丙、丁四型。
流感病毒的检测对于流感的防治工作至关重要，但流感病毒的分型与临床诊疗有何关联？抗病毒药物的耐药性突变位点如何检测？新一代的测序技术又有哪些优点？医院呼吸中心、临床微生物与感染实验室、呼吸疾病国家临床研究中心的邹晓辉博士将从上述几个方面为我们做详细的讲解。
01
流感的分型与鉴定
流感病毒的鉴定和分型方法主要有病毒分离培养、免疫学方法和分子检测方法，不同的方法，病毒检测时间窗口也不相同。
图1病毒检测时间窗口
病毒培养是流感病毒鉴定的金标准，可以进行后续的抗原耐药监测实验，但实际操作耗时费力，常需要5~7天，且无法大规模临床诊断使用
免疫学方法中，血清学方法可以精确到亚型和病毒系水平，可以进行大批量样本操作，常常用在人群水平的血清学监测，在临床上一般用来做回顾性研究；胶体金方法检测速度快，时间短，常在10~15min即可得到结果，但准确性较低，不能作为流感阴性确诊的标准。
PCR检测技术通过特异性引物的指数扩增，可使靶序列从单拷贝水平扩增到极大数量级，极大地提高了检测灵敏度和特异性，是当前分子检测的主要技术手段。常规PCR检测技术由于耗时费力已经逐渐淘汰，目前各临床机构采用的均是荧光定量PCR检测技术。
图2PCR原理及相关技术
02
抗病毒药物耐药性突变位点如何检测？
流感病毒的耐药情况是影响流感治疗的重要因素。目前流行的pdmH1N1和H3N2毒株全部对M2离子通道抑制剂耐药，因此不推荐使用M2离子通道抑制剂进行当前流感的治疗。年9月以来，所有流行的H3N2和B型流感对奥司他韦均敏感。除2株甲型H1N1（pdmH1N1）毒株对神经氨酸酶抑制剂的敏感性高度降低，其余甲型H1N1毒株均对神经氨酸酶抑制剂敏感。法匹拉韦对季节性流感和禽流感均有效，对奥司他韦耐药的流感也有效。法匹拉韦目前仅在日本上市，在美国进行三期临床试验中并未发现耐药，但在细胞水平发现耐药。
检测方面，目前使用的MGB探针检测，其特异性高，可区分单个碱基的突变，由于PCR荧光通道的限制，一般PCR仪最多检测6个通道；数字PCR技术可用于病毒的定量检测，与传统病原定量方式相比，具有无需标准曲线的绝对定量、检测超低频突变、成本较低等特点。
图3数字PCR技术
此外，一些新的流感即时分子技术诊断技术可同时报告甲流、乙流或其他呼吸道病毒。此类技术基于PCR技术原理，具有高度敏感性和特异性，同时具有检测方便、时间较短、所需样本量少等优点。
03
新一代测序技术（NGS）
NGS技术在流感病毒检测中具有广阔的应用前景，其优势主要表现为以下3个方面：
1）由于流感病毒基因组八条片段末端序列保守，因此可以利用保守区设计引物，在一个反应中扩增出流感病毒基因组所有片段，避免了设计多对引物的巨大工作量。
2）二代测序相对于一代测序成本大大降低，可以实现大量流感病毒全基因组的测定，方便进行分子流行病学分析。
3）流感病毒高度变异，已设计的特异性引物在目标病毒变异时可能会脱靶，而二代测序利用流感病毒末端的保守序列设计引物，对变异病毒同样适用。
图4NGS技术原理：边合成边测序
除二代测序外，三代测序技术——新型纳米孔测序法也逐渐被推广使用。纳米孔测序采用电泳技术，借助电泳驱动单个分子逐一通过纳米孔来实现测序，对基因片段覆盖度更均匀，准确率也高达99%。
04
小结
目前对于流感病毒的检测中，胶体金快检方法阳性结果有临床诊断意义，阴性结果不能作为排除流感感染的依据；而PCR方法相对简单、准确性较高，是流感病毒亚型鉴定和耐药位点鉴定常用的方法，在大部分医疗机构均可进行。
责任编辑：马腾、李婷
图片来源：丁香园出品
配图来源：医院邹晓辉博士提供
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