疫苗质量控制在口蹄疫疫苗生产程序中非常重要。生产合格的高品质疫苗是预防口蹄疫的重要保证。由于不同国家和地区及不同实验室所采用的监控技术方法不尽一致，所以迄今国际上还没有一个统一的标准方法来控制疫苗质量。本文对检测口蹄疫疫苗中间品和成品的的各类方法作简介。
1.生产过程
1.1质量控制
口蹄疫灭活疫苗的生产必须严格在GMP标准级的厂房内，要在QA系统的框架内，按照规定的制苗规程来进行，必须达到可以防止任何源自生产工厂的病毒逃逸的生物安全级别。
GMP生产车间内应严格密闭，在与外界相通处要安装双HEPA过滤器来过滤所有的空气，疫苗的生产应在无菌的不锈钢管道内或其他生产线设备中进行，在活病毒存在的区域内要产生规程要求的梯度负压级别，材料和人员进出负压区均需消毒等一系列的措施。
严格保证制苗原辅料品质：由于口蹄疫疫苗配制成分中有很多生物源性的材料，例血清、蛋白胨和动物源性水解乳蛋白等，所以必须要求这些产品的供货商提供相关品质检验报告。例欧盟的//EC官方指令明确要求检测这些原料产品中是否含有牛海绵状脑病病毒。
疫苗用种毒株的质量直接影响到终产品的好坏，所以应严格加以控制。理想的种毒应该具备以下特性：在细胞培养物上容易生长、病毒产量高、稳定性强以及抗原谱广，具有良好的抗原性和免疫原性；官方的监察实验室应按照疫情流行特点对生产用种毒毒株进行筛选、定性和分发；由于口蹄疫病毒本身具有容易发生变异的特点，因而有必要建立和完善种毒的种子批制度，同时种毒的传代次数也应尽可能的少；所有生产用毒株应由官方的口蹄疫参考实验室标明其生物学特性并分类保存。目前，口蹄疫疫苗生产厂家一般都是使用乳仓鼠肾细胞（BHK-21）克隆13传代细胞系，进行悬浮培养。
细胞单层培养系统属于劳动力密集型的生产系统，人为不确定因素多，相对容易污染和散毒，因而提高生产工作人员的专业技能和无菌操作技术是关键因素，必须按照GMP规范所要求的，生产人员经培训合格后方可上岗。悬浮培养系统属于技术密集型生产系统，操作相对容易，并且不易散毒，因而保证整个生产密闭系统内的无菌状态，调节好细胞生长的各种最佳生长条件是更加重要的。
口蹄疫的双价苗生产技术已经成熟，并用于大批量的生产。对于其质量控制最关键的部分在于必须保证各型口蹄疫病毒的种毒保存和生产彼此在严格隔离的环境中，在病毒被灭活前，严防两型病毒的相互交叉污染。同时应注意口蹄疫病毒血清型抗原性差异及配制联苗时，调配抗原的比例。
病毒灭活剂的选择是非常重要的。乙烯亚胺类衍生物是较为理想的灭活剂，它可以直接破坏病毒的核酸，比传统灭活剂甲醛更加安全，同时它对病毒抗原蛋白的破坏力更小，因而使疫苗具有更好的免疫原性。灭活时使用双灭活罐系统，更加保证了病毒灭活的彻底性，必须达到每升病毒灭活液里含有的活病毒粒子要少于1个，相当于万头份剂量的疫苗液中，不能有多于1个活病毒。4年巴西的DaniellaIshimaru等人报道了使用流体高压来灭活口蹄疫病毒，他们对FMDVO1Campos-vallee（CVa）株进行了试验，在-15℃使用2.5千帕的液体高压，同时加入1M尿素来对FMDV进行灭活。结果发现病毒完全丧失了感染性，同时病毒本身的衣壳蛋白结构没有被破坏，并保留了诱导兔体产生中和抗体的能力。这种方法安全、简单、便宜并且可重复性好。
为了获得高效的疫苗，同时降低疫苗中非病毒蛋白引起的变态反应，对灭活后的病毒液进行抗原的纯化浓缩是控制疫苗质量的关键步骤之一。当前应用于大规模工厂生产的纯化浓缩方法主要是超滤法、聚乙二醇（PEG）或聚乙烯氧化物（PEO）沉淀法和色谱柱过滤法等。选择质量优良的超滤系统是重要的，必须严格保证超滤系统的无菌，同时定期检查和更换滤芯确保纯化浓缩的效果。
使用优良的佐剂是提高疫苗质量的重要方法。目前，我国所使用的佐剂以矿物油为主，由于国产矿物油纯度和均匀性有待提高，引起的动物体的副反应很大，因而探索研究新型高效副反应小的佐剂成为了迫切的需要，例如MontanideISA和ISA的使用就大大的简化了疫苗的配制，0年印度的A.V.Iyer等人报道了他们比较了ISA、ISA57和ISA50V三种油佐剂所诱导的动物体保护应答效果，发现ISA57诱导动物体保护免疫应答效果最好。最近有报道称用分枝杆菌细胞壁的可溶性部分、合成硫辛酰胺、avidine等作佐剂生产FMDV油佐剂灭活疫苗，可以降低抗原的用量，同时增强FMDV的细胞免疫应答。此外，能够将抗原定向于网状内皮系统、延长抗原免疫刺激时间、降低疫苗副反应的脂质体佐剂、一些能够显著增强免疫效果的牛源和猪源细胞因子（牛IFN-α、猪IL-18和IFN-β）和更多的具有低毒、无免疫原性、安全性好且具有优良生物相容性的可生物降解微球蛋白等新型佐剂的研究和开发将对提高疫苗质量起到更重要的作用。
1.2检测技术
为保障疫苗品质，对生产疫苗用的各种原材料都必须进行严格的无菌检验、支原体检验和外源病毒的检验及其他一些规定的检测，其常规技术这里不做一一列举，详细参见我国最新版的《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》。在此仅重点简述生产过程中：
对制苗用的各个工作批次的种毒进行型特异性鉴定是必不可少的。常用的方法有间接夹心ELISA和补体结合试验。5年印度学者PalaniGiridharan等报道了使用多重PCR检测了39个细胞培养样品，区分O、A、AsiaI和C型四种不同血清型，检验的符合率高达%，具有高度的特异性和敏感性（C型的敏感性相对较低），而且可以用来检测已用ELISA方法测定阴性的样本，并具有很好的敏感性和可靠性。
测定FMD病毒滴度的常用方法是组织细胞培养法和乳鼠接毒法，组织细胞培养法主要使用实验重复性较好的BHK21传代细胞系来进行，通过在显微镜下观察不同稀释度的FMD病毒感染BHK21细胞时所产生的CPE来判定实验结果，实验耗时较长，人为因素影响较大。目前，国外一些实验室和疫苗公司采用病毒蚀班减数测定法，该法操作方便，判定方法简单快捷，测定结果也很准确，值得借鉴。
口蹄疫病毒中的S全病毒粒子是主要的免疫原，生产过程中这种病毒粒子任何形式的降解都会导致疫苗免疫效力的下降。传统的方法是通过补体结合（CF）试验来估测出总抗原含量（S和12S），然后经氟化碳处理除去12S抗原或超速离心S以后，还可直接或间接估测出主要免疫原S的CF量。目前，一些生产厂家通过蔗糖密度梯度离心法来获得一定体积口蹄疫病毒液中的S病毒粒子，使用紫外分光光度计在nm或nm紫外光下来梯度测定其含量。采用这种简单的方法可以快速的测定出在紫外分光光度计图表中病毒峰区域的S全病毒粒子的含量并且可以用于监测生产过程中病毒和抗原的收获量，当然也可以用于成品疫苗中S抗原含量的测定。国外更为精确的测定病毒抗原量和质量的方法是通过氯化铯密度梯度离心定量分析，在每毫升微克量水平估测出病毒抗原的S数量，并用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测病毒抗原多肽的完整性以确定其质量。国际上许多实验室对口蹄疫疫苗中各血清型病毒的主要免疫原S粒子的含量，都有具体的参数和标准。
病毒液经灭活后必须进行安全性试验。批量产品的采样按1份/≥头剂的比例随机抽取。所有样品应通过在易感的单层细胞上进行接毒感染试验来检验其是否含有活病毒，检验所用的单层细胞最好与繁殖病毒用的细胞同源。接种了病毒灭活液的单层细胞应连续培养、观察三天，之后，将旧的营养液移到新的单层细胞培养瓶而在原有的单层细胞培养瓶中补充进新的营养液。用此方法，微量的活病毒可经传代得到增殖并通过观察CPE来确定检验结果。通常只需传代两三次。此法有一变通方案：冻融旧的单层细胞以释放出细胞内的病毒，再经传代可检出活病毒。
2.终产品
2.1质量控制
为了保证成品口蹄疫疫苗在生产实际中能够安全有效的应用，对于成品疫苗的质量控制是至关重要的。不仅生产厂家本身要对其生产疫苗从理化特性、无菌性、安全性、免疫效力等方面进行自检，而且官方兽药监管检验机构也要不定期的随机抽检厂家生产的口蹄疫疫苗，重点对成品疫苗各项技术指标进行复检，评价疫苗的质量，并实行批签发制度，督促生产厂家保证成品疫苗的质量。
2.2检测技术
针对口蹄疫成品疫苗的检测主要包括无菌检验、安全性检验和效力试验等。目前多数国家都使用OIE推荐的及某些改进的方法和系统来对成品口蹄疫灭活疫苗进行检验：
无菌检验中，对需氧菌、厌氧菌及酵母和真菌接种适宜培养基进行培养检验。
安全性检验，应选择对疫苗不利因素最为敏感的动物来进行，同时应满足规程的要求。
目前，国际上通用的疫苗效力检测试验就是本动物攻毒试验，欧洲大多数国家采用的百分之五十保护剂量（PD50）测定法，这种方法对试验动物的要求必须是来自无口蹄疫地区并从未进行过FMD免疫，血清无任何型FMD病毒中和抗体，大于六个月龄的牛。这使得疫苗生产厂家和兽药监管机构检测疫苗时，实验动物的获取就有着相当大的困难，更别提要动用大量的人力和财力了，同时还有散毒的危险。而南美国家多采用直接动物攻毒测定疫苗保护百分率（PDP）法：选择18～24月龄健康无口蹄疫感染牛16头，分别免疫1头份疫苗，免疫后28天以牛半数感染量（ID50）病毒舌面攻毒感染16头免疫牛和2头未免疫对照牛，观察7天，至少12/16免疫牛获得攻毒保护，则该疫苗合格。同时OIE也同意一些选择性的替代试验可以被使用。因而世界各国的研究人员都在努力研究新的可以替代本动物攻毒试验的方法。国外一些学者报道使用豚鼠来做为口蹄疫病毒人工感染的模型动物，不但可以通过抗体检测，而且也具有相应的临床症状和典型的病理变化，可以被用做口蹄疫疫苗的效力检验，此后各国研究人员都对此做了深入的研究，但是到目前为止，仍未有一个像本动物攻毒试验那样，有着确定统一的标准。有大量发表的数据证明，高的体液抗体水平和保护水平相关。大量的技术被用来检测体液中的抗体水平并分析抗体滴度与保护力在统计学意义上的关系。年O.H.Periolo和C.Seki等人使用由Hamblinefal改进的液相阻断ELISA（lpELISA）方法在阿根廷大规模应用评价已接种油佐剂口蹄疫疫苗牛的保护性免疫，他们以商品化四价油佐剂疫苗免疫的头动物以及头未免疫的阴性动物中，应用液相封闭夹心ELISA检测四种口蹄疫病毒株的特异性血清活力水平，结果显示血清LpELISA效价水平与动物的保护百分比直接相关；之后阿根廷的B.Robiolo等人使用批商品口蹄疫苗来对头牛进行免疫，在免疫后60天（d.p.v.）采取这些动物的血液，分离血清，使用他们组建的液相阻断ELISA方法（lpELISA）测定血清效价，并且在免疫后90天（d.p.v.）用活口蹄疫病毒进行攻毒，确定疫苗保护力。然后分析发现使用他们的lpELISA方法评价疫苗的效力（即测定最低期望保护率，LEP）与本动物实验的结果相比，有高达95%的可信度。lpELISA具有高度的特异性，他们通过使用一个相关系数（Ro）来更进一步的提高这种评估方法的可靠性，依据所获得的大量数据并进行了深入的分析后，他们建议对使用商品口蹄疫疫苗免疫后60天（d.p.v.）的动物测定其LEP值，如果LEP达到82%（或Ro≥4）时，判定该批疫苗效力检验合格；如果LEP低于50%（或Ro＜0.50）时，判定该批疫苗效力检验不合格；而鉴于两者之间的，则应使用其他已选的攻毒毒株进行复检，测定其最低的Ro，达到标准后，方可判定合格。年Tsuda等首先证实了康复牛血清中的抗体几乎都为l46S抗体，利用了这一特性进行单向免疫扩散试验检测疫苗抗原中的S，并认为可以与本动物保护性试验比较，确定相关性，以一定大小的扩散环作为标准，定量S抗原，达到替代本动物保护性试验的效果。用现代新技术计算机软件进行色谱分析估测疫苗中S抗原量是Shirai等年提出的。色谱分析所得数据与紫外分析后计算S峰区面积和比重，所得数据有显著差异，其所测的8批疫苗计算机色谱分析所得数据分别为2.-0.07g/mIJ,3.00±0.05Pg/ml、2.84±0.23g/ml,4.30±0.27g/ml,3.31±0.08g/ml,4.07±0.g/ml，3.56±0.14Pg/ml、3.59±0.07g/ml，其疫苗在动物体的保护率分别是80％、95%、80%、%、80%、95%、80%和%。因此Shirai认为可用这种方法来代替动物保护性试验，从多方面来说都是有利的，不但方便且又安全，在泰国口蹄疫疫苗生产中心检测应用认为是可行的。口蹄疫疫苗中S抗原量达到一定程度才能说明这种疫苗质量良好，目前泰国口蹄疫疫苗生产中心所生产的O型灭活疫苗，其S含量在2.0Pg/ml以上，认为是合格的。
来源：中农威特生物科技股份有限公司
